Polarizarea fluorescenței (FP) este o tehnică puternică folosită în diverse domenii, inclusiv biochimie, farmacologie și științe de mediu. Ca furnizor de detector de fluorescență lider, înțelegem importanța măsurătorilor FP exacte și fiabile. În această postare pe blog, vom explora cum să măsurați polarizarea fluorescenței, de la principiile de bază la considerentele practice.
Principiile de bază ale polarizării fluorescenței
Polarizarea fluorescenței se bazează pe faptul că atunci când o moleculă fluorescentă este excitată de lumina polarizată, lumina emisă este, de asemenea, polarizată. Gradul de polarizare a luminii emise depinde de mișcarea de rotație a moleculei fluorescente în timpul duratei de viață a fluorescenței. Dacă molecula este mare sau legată de o macromoleculă, mișcarea sa de rotație este restricționată, iar lumina emisă rămâne extrem de polarizată. În schimb, dacă molecula este mică și liberă în soluție, mișcarea sa de rotație este rapidă, iar lumina emisă devine depolarizată.
Polarizarea fluorescenței este cuantificată prin valoarea de polarizare (P), care este definită ca diferența dintre intensitățile componentelor polarizate vertical și orizontal ale luminii emise împărțite la suma lor:
[P = \ frac {i _ {\ paralel} -i _ {\ perp}} {i _ {\ paralel}+i _ {\ perp}}]
unde (i _ {\ paralel}) este intensitatea luminii emise polarizate vertical și (i _ {\ perp}) este intensitatea luminii emise polarizate orizontal.
Instrumentare pentru măsurarea polarizării fluorescenței
Pentru a măsura polarizarea fluorescenței, aveți nevoie de un detector de fluorescență echipat cu optică de polarizare. Compania noastră oferă o serie de detectoare de fluorescență de înaltă calitate, inclusivDetector de fluorescență izotermășiDetector digital de fluorescență izotermă, care sunt concepute special pentru măsurători FP exacte și sensibile.
Aceste detectoare constau de obicei din următoarele componente:
- Sursă de lumină: O sursă de lumină, cum ar fi o lampă de xenon sau un laser, este utilizată pentru a genera lumina de excitație. Lumina trebuie polarizată înainte de a ajunge la eșantion.
- Polarizatoare: Polarizatorii sunt folosiți pentru a controla polarizarea excitației și a luminii de emisie. Polarizatorul de excitație este plasat pe calea luminii de excitație pentru a se asigura că este polarizat liniar. Polarizatorul de emisie este plasat în fața detectorului pentru a măsura componentele polarizate vertical și orizontal ale luminii emise.
- Suport de probă: Un suport de eșantion este utilizat pentru a menține eșantionul pe calea luminii de excitație. Ar trebui să fie proiectat pentru a minimiza împrăștierea luminii și fluorescența de fundal.
- Detector: Un fotodetector, cum ar fi un tub fotomultiplicator (PMT) sau un dispozitiv cuplat de încărcare (CCD), este utilizat pentru a măsura intensitatea luminii emise. Detectorul ar trebui să poată măsura intensitățile componentelor polarizate vertical și orizontal separat.
Configurare experimentală pentru măsurători de polarizare a fluorescenței
Următorii pași sunt implicați în crearea unui experiment pentru a măsura polarizarea fluorescenței:
- Selectați sonda fluorescentă corespunzătoare: Alegeți o sondă fluorescentă potrivită pentru aplicația dvs. Sonda ar trebui să aibă un randament cuantic ridicat și o durată de viață fluorescentă lungă.
- Pregătiți eșantionul: Pregătiți eșantionul dizolvând sonda fluorescentă într -un tampon adecvat. Dacă studiați o interacțiune de legare, adăugați ligandul sau macromolecula la eșantion la concentrația corespunzătoare.
- Calibrați instrumentul: Calibrați detectorul de fluorescență conform instrucțiunilor producătorului. Aceasta poate implica ajustarea câștigului detectorului, stabilirea lungimilor de undă de excitație și a emisiilor și măsurarea fluorescenței de fundal.
- Măsurați valorile de polarizare: Puneți eșantionul în suportul eșantionului și măsurați intensitățile componentelor polarizate vertical și orizontal ale luminii emise. Calculați valoarea de polarizare folosind formula menționată mai sus.
Factori care afectează măsurătorile de polarizare a fluorescenței
Mai mulți factori pot afecta precizia și fiabilitatea măsurătorilor de polarizare a fluorescenței:
- Temperatură: Mișcarea de rotație a moleculei fluorescente depinde de temperatură. O creștere a temperaturii duce la o creștere a mișcării de rotație și la o scădere a valorii de polarizare. Prin urmare, este important să se mențină o temperatură constantă în timpul măsurării.
- Vâscozitate a solventului: Vâscozitatea solventului afectează mișcarea de rotație a moleculei fluorescente. Un solvent mai vâscos restricționează mișcarea de rotație și crește valoarea de polarizare.
- Concentrația sondei fluorescente: Concentrația sondei fluorescente poate afecta valoarea de polarizare. La concentrații mari, pot apărea auto -stingerea și agregarea sondei, ceea ce duce la măsurători inexacte.
- Fotoblaching: PhotobLeaching este distrugerea ireversibilă a moleculei fluorescente prin lumina de excitație. Poate duce la o scădere a intensității fluorescenței și poate afecta măsurarea polarizării. Pentru a reduce la minimum fotoblocare, utilizați o lumină de excitație scăzută de intensitate și timpi de expunere scurtă.
Aplicații de polarizare a fluorescenței
Polarizarea fluorescenței are o gamă largă de aplicații în diferite domenii:
- Descoperirea drogurilor: FP este utilizat pentru a studia interacțiunile de legare dintre medicamente și țintele lor. Prin măsurarea valorii de polarizare, puteți determina afinitatea de legare și constanta de disociere a complexului țintă.
- Imuno -analize: Imuno -analize pe bază de FP sunt utilizate pentru a detecta prezența antigenelor sau anticorpilor în probe biologice. Legarea antigenului la sonda fluorescentă cu anticorp duce la o modificare a valorii de polarizare, care poate fi utilizată pentru a cuantifica analitul.
- Analiza acidului nucleic: FP poate fi utilizat pentru a studia hibridizarea acizilor nucleici. Legarea unei oligonucleotide marcate fluorescent la secvența sa complementară duce la o modificare a valorii de polarizare, care poate fi utilizată pentru a detecta și cuantifica acidul nucleic țintă.
Depanare măsurători de polarizare a fluorescenței
Dacă întâmpinați probleme în timpul măsurătorilor de polarizare a fluorescenței, pot fi de ajutor următoarele sfaturi de depanare:
- Valori scăzute de polarizare: Dacă valorile de polarizare sunt mai mici decât se aștepta, verificați dacă sunt factori precum temperaturi ridicate, vâscozitate scăzută a solventului sau concentrație mare a sondei fluorescente.
- Fluorescență de fundal ridicată: Fluorescența de fundal ridicată poate fi cauzată de impurități din eșantion sau solvent sau de împrăștiere de lumină. Purificați proba și utilizați un solvent curat. Asigurați -vă că suportul eșantionului este curat și lipsit de zgârieturi.
- Măsurători inconsistente: Măsurătorile inconsistente se pot datora fotoblocarii, alinierii slabe a polarizatorilor sau fluctuațiilor sursei de lumină. Minimizați fotobloarea, verificați alinierea polarizatorilor și asigurați -vă că sursa de lumină este stabilă.
Concluzie
Măsurarea polarizării fluorescenței este o tehnică valoroasă pentru studierea interacțiunilor de legare și a dinamicii moleculare a moleculelor fluorescente. În calitate de furnizor de detector de fluorescență, ne -am angajat să oferim instrumente de înaltă calitate și suport tehnic pentru a vă ajuta să obțineți măsurători FP exacte și fiabile. Fie că lucrați în descoperirea medicamentelor, imuno -analize sau analiza acidului nucleic, a noastrăDetector de fluorescență izotermăşiDetector digital de fluorescență izotermăvă poate satisface nevoile.
Dacă sunteți interesat să achiziționați detectoarele noastre de fluorescență sau aveți întrebări cu privire la măsurătorile de polarizare a fluorescenței, vă rugăm să ne contactați pentru o consultare detaliată și negocieri de achiziții. Echipa noastră de experți este gata să vă ajute în selectarea celui mai potrivit instrument pentru aplicația dvs.
Referințe
- Lakowicz, Jr (2006). Principiile spectroscopiei fluorescente. Springer Science & Business Media.
- Szollosi, J., & Damjanovich, S. (2004). Polarizarea fluorescenței: un ghid practic. În protocoale curente în citometrie (pp. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.