Tehnologiile de diagnostic molecular astăzi evoluează într -un ritm fără precedent, cu progrese semnificative în ultimii doi ani. Printre acestea, tehnologiile de amplificare izotermă au câștigat mai multă atenție datorită capacității lor de a efectua amplificarea fără a fi nevoie de echipamente specializate. Există mai multe metode cunoscute de amplificare izotermă, cum ar fi LAMP, RPA și RAA. Cu toate acestea, astăzi vreau să introduc o tehnologie de amplificare izotermă mai nouă-MIRA.
Pentru a se asigura că toată lumea are o înțelegere constantă a conceptelor cheie, iată câteva explicații de termen:
- Amplificarea recombinazei polimerazei (RPA): Aceasta este o tehnologie de amplificare mediată de recombinază.
-Amplificare asistată de recombinază (RAA): o metodă similară de amplificare mediată de recombinază.
- Amplificare izotermă mediată de buclă (LAMP): o altă tehnică de amplificare izotermă.
- Amplificare rapidă izotermă multienzime (MIRA): o nouă tehnologie izotermă de amplificare rapidă.
Rezumat rapid și clarificare:
Mulți s -ar putea întreba care dintre aceste diferite metode de amplificare izotermă este mai fiabilă și mai stabilă. În realitate, fiecare tehnologie are punctele forte și limitările sale. Cu toate acestea, factorii cheie pentru adoptarea cu succes sunt capacitatea de a extinde producția în mod fiabil, costuri reduse și performanță robustă în diverse aplicații.
Acum voi analiza pe scurt fiecare tehnologie pe baza a ceea ce știu:
Lampa (amplificare izotermă mediată de buclă):
Mulți din domeniu știu că lampa își are originea în Japonia, dezvoltată de Dr. Notomi în 2000 ca o nouă tehnică de amplificare a genelor. În prezent, proprietatea acestei tehnologii aparține companiei japoneze Eiken Chemical Co., Ltd.
Avantaje:
- Sensibilitate ridicată (2-5 ordine de mărime mai mari decât metodele tradiționale PCR).
- Timp de reacție scurt (reacțiile pot fi finalizate în minute 30-60).
- Nu este nevoie de instrumente speciale în uz clinic (deși este recomandat un turbidimetru în timp real în timpul dezvoltării kitului).
- Ușor de funcționat (indiferent dacă detectează ADN sau ARN, procesul implică amestecarea soluției de reacție, enzimelor și șablonului într -un tub de reacție, apoi incubarea la aproximativ 63 de grade pentru 30-60} minute într -o baie de apă sau incubator, cu rezultatele observabile de ochiul liber).
Dezavantaje:
- Sensibilitatea ridicată poate duce la contaminarea aerosolului odată ce tubul este deschis, ceea ce îl face impropriu pentru utilizarea în afara unui laborator PCR din cauza unui risc ridicat de false pozitive.
- Proiectarea grundului este dificilă, ceea ce îl face impropriu pentru unele boli, în special cele cauzate de viruși cu puține secvențe comune.
- Aplicația sa este relativ limitată.
RPA și RAA Tehnologii de amplificare izotermă:
Aceste două metode sunt în mare măsură omologe, principala diferență fiind sursa recombinazei utilizate.
- Recombinaza RPA provine de la bacteriofagul T4.
- Recombinaza RAA este derivată din bacterii sau ciuperci.
Puncte cheie ale principiului de lucru:
1. În prezența ATP, recombinaza se leagă de primer, formând un complex de acid proteic-nucleic, care apoi caută ADN-ul țintă potrivit.
2. Odată ce primerul găsește șablonul ADN -ului potrivit, hidroliza ATP oferă energia pentru recombinază pentru a părăsi primerul, iar ADN polimeraza sintetizează o nouă catenă ADN.
3. În același timp, proteinele de legare a ADN-ului (SSB) se leagă la o catenă deplasată pentru a preveni reformarea dublei.
Avantaje:
- Reacția RPA/RAA este foarte rapidă, rezultatele obținute în aproximativ 30 de minute.
- Sensibilitatea poate atinge 10 exemplare/µl.
- Nu este nevoie de echipamente complexe în timpul amplificării.
-Dezvoltarea ulterioară a metodelor de cromatografie de aur bazate pe sonde sau coloidale de aur simplifică foarte mult interpretarea rezultatelor, ceea ce le face bine potrivite pentru utilizarea în zonele limitate de resurse sau defavorizate economic.
Dezavantaje:
- RPA este o tehnologie dezvoltată de compania britanică TwistDX, care este acum deținută de Abbott, ceea ce duce la costuri mari, cicluri de aprovizionare îndelungate și lipsă de asistență tehnică. Acest lucru face dificilă aplicarea la scară largă și producția în masă în China.
- RAA este o tehnologie pur internă, dar îi lipsește stabilitatea în ceea ce privește rezistența la interferențe și consistența reactivului de produse. Mai mult, procesul de fabricație pentru enzimele funcționale are nevoie de îmbunătățiri. Deși tehnologia a fost pe piață de cinci ani, nu a fost încă adoptată pe scară largă din cauza problemelor de stabilitate și versatilitate.
- Atât RPA, cât și RAA necesită primeri care sunt 30-35 bp în lungime. Primerii mai scurti afectează specificitatea, sensibilitatea și viteza de amplificare, ceea ce face ca designul primerului să fie provocator.
Mira (multienzimă izotermă amplificare rapidă):
Mira este o nouă tehnologie de amplificare izotermă introdusă la mijlocul -2019. Este omolog pentru RPA și RAA.
Deși Mira împărtășește asemănări cu RPA și RAA în ceea ce privește principiile de lucru, există diferențe semnificative în selecția enzimelor, cultivarea, purificarea și alte aspecte ale producției pe scară largă. Mai mult decât atât, echipa tehnică din spatele dezvoltatorului Mira, Ampfuture, a petrecut aproape 11 ani perfecționând tehnologia. Acum este complet echipat pentru a sprijini dezvoltarea de reactivi gata de utilizare, dezvoltare personalizată, proiecte de cercetare și alte servicii personalizabile.
Avantaje:
1. Proteinele funcționale din reactivii MIRA sunt provenite din diverse enzime, unele enzime supuse modificărilor vizate pentru a îmbunătăți eficiența sistemului enzimatic de bază, rezultând un sistem mai cuprinzător.
2. Rezistență puternică de interferență și stabilitate. Reactivii Mira suferă o optimizare extinsă în ceea ce privește selecția și concentrația cofactorului, împreună cu procesele de producție de uscare a congelalelor, ceea ce le face mai rezistente la interferențe și mai stabile.
3. personalizare și versatilitate. Datorită controlului complet asupra producției de proteine funcționale și o înțelegere profundă a tehnologiei, MIRA poate fi adaptat la diverse aplicații, oferind diferite sisteme de reactivi și servicii personalizate de personalizare.
4. Brevete de proprietate. Deoarece Mira este 100% dezvoltat pe plan intern, nu există niciun risc de încălcare a brevetelor în timpul dezvoltării produsului. Acest lucru oferă Mira un avantaj competitiv atât pe piețele interne, cât și pe cele internaționale.
5. A fost stabilit un protocol de producție complet, permițând o producție stabilă pe scară largă.
Dezavantaje:
1. Recunoașterea pieței este încă scăzută și sunt necesare mai multe date și referințe din diferite domenii (cum ar fi rate pozitive în diferite domenii) pentru a obține o acceptare mai largă.
2. Proiectarea primerului urmează în continuare caracteristicile RPA sau RAA, necesitând secvențe de grund sau sonde mai lungi, ceea ce poate să nu faciliteze un comutator rapid pentru utilizatorii actuali PCR.