Partajare articole丨O platformă CRISPR-Îmbunătățită cu inteligență artificială-Cas14a microfluidică pentru detectarea exactă-la locație a geminivirusurilor în plantele de tomate și muștele albe

Geminivirusurile reprezintă o amenințare severă pentru producția globală de tomate prin evoluția rapidă și transmiterea mediată de muștele albe la nivel mondial. Metodele actuale de detectare vizează în primul rând plantele simptomatice, oferind adesea rezultate de diagnostic numai după ce încărcările virale au atins niveluri transmisibile, făcând controlul bolii ineficient. Intervenția timpurie depinde de identificarea infecțiilor înainte de apariția simptomelor-sau chiar de detectarea prezenței virale în insectele vectori înainte ca aceștia să transmită viruși la plante. În timp ce progresele recente în amplificarea izotermă și diagnosticarea bazată pe CRISPR-oferă soluții potențiale, implementarea practică se confruntă cu limitări inerente: incompatibilitatea dintre amplificarea enzimatică și sistemele CRISPR, riscurile de contaminare din procedurile în mai multe etape și adaptabilitatea inadecvată la câmp a dispozitivelor de detectare. Pentru a face față acestor provocări, am dezvoltat MaC14a-o platformă microfluidică îmbunătățită AI-care integrează amplificarea rapidă izotermă asimetrică multienzimă (aMIRA) cu CRISPR-Cas14a. Acest sistem depășește barierele tehnice cheie prin optimizarea stoichiometriei primerului pentru a genera ssDNA pentru activarea Cas14a independentă de PAM-, realizând o detecție ultrasensibilă (10 fM), eliminând în același timp contaminarea încrucișată prin reacții cu un singur-tub. Împreună cu un cip microfluidic centrifugal, detecție optică portabilă și interpretare a semnalului bazată pe-învățare automată, MaC14a permite detectarea multiplexată a patru geminivirusuri în decurs de 5 minute, demonstrând o acuratețe de diagnostic de 100 % atât pentru mostrele de plante, cât și pentru muștele albe. Recunoașterile sale includ: (i) detectarea presimptomatică a infecției la plante și (ii) determinarea precisă a transportului viral la muștele albe individuale-completând un gol tehnologic critic în supravegherea pre-transmiterii. Dincolo de a oferi un instrument nou pentru gestionarea geminivirusului, acest studiu stabilește o paradigmă „AI-CRISPR-microfluidics” pentru protecția culturilor. Prin schimbarea atenției de la plantele simptomatice la vectorii viruliferi și infecțiile asimptomatice, această tehnologie oferă o soluție transformatoare pentru a perturba ciclurile de transmitere virală la sursa lor.

Flux de lucru integrat al sistemului MaC14a pentru supravegherea multiplex geminivirus.

(A) Mecanismul de detectare a acidului nucleic mediat de aMIRA-Cas14a-. Schemă care ilustrează amplificarea ssDNA condusă de aMIRA-cuplată cu recunoașterea ssADN-ului independent PAM de la Cas14a și activitatea colaterală de clivaj, permițând detectarea unui singur-tub (compatibil cu instrumente PCR fluorescente{-în timp real) sau pe site-ul-prin analiză centrifugă{9}microfluidică personalizată dispozitive). (B) Flux de lucru de detectare microfluidică (MaC14a) pentru diagnosticare implementabilă pe teren-. Pașii de timp sunt indicați prin săgeți, care arată durata fiecărui proces din analizatorul portabil. (C) Diagramă a algoritmului de-detecție în timp real bazat pe rețelele de memorie pe termen lung și scurt{16}(LSTM). Algoritmul optimizat facilitează procesarea-în timp real a semnalelor de fluorescență, permițând interpretarea rezultatelor în 5-10 minute.

Sistemul de detectare aMIRA-Cas14a

(A) Diagrama schematică ilustrează mecanismul de reacție al platformei de detectare aMIRA-Cas14a. (B) Activitatea specifică de scindare a Cas14a pe produsele aMIRA a fost verificată prin analiza electroforezei pe gel (C) Analiza comparativă a metodelor de detectare Cas14a cu un-pas și doi-pasi-aMIRA-. Notă: în protocolul de reacție în doi-pași, procesul începe cu o amplificare aMIR de 20-minute, urmată de adăugarea sistemului de detectare Cas14a pentru monitorizarea fluorescenței. În consecință, colectarea semnalelor de fluorescență inițiază la momentul de timp de 20 de minute. (D) și (E) Au fost efectuate experimente de optimizare pentru a determina rapoartele optime de primer și invers. (F-I) Specificitatea sistemului aMIRA-Cas14a a fost validată prin detectarea a patru ținte virale distincte (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV și TbCSV) în probe de plante. Proba mixtă (denumită ca Mix) a fost preparată prin combinarea unor volume egale din fiecare preparat ADN viral.

Pentru a obține amplificarea semnalului pentru urme de acizi nucleici virali și pentru a oferi suficiente substraturi pentru Cas14a, am dezvoltat aMIRA (amplificare rapidă izotermă asimetrică multienzimă) bazată pe MIRA. Sistemul aMIRA-Cas14a rezultat oferă următoarele avantaje cheie:

1. Stoichiometria optimizată a primerului permite MIRA să producă în mod preferențial ssDNA, care servește drept substrat direct pentru Cas14a. Prin ajustarea raportului de primer-la-invers la 20:1, sistemul generează suficient ssADN pentru a activa activitatea de scindare independentă PAM-a Cas14a, care recunoaște și scindează în mod specific ssDNA.
2. Integrarea într-un singur vas a MIRA și CRISPR-Cas14a elimină riscurile de contaminare încrucișată.
3. MIRA îmbunătățește semnificativ sensibilitatea de detectare, permițând detectarea acizilor nucleici virali cu abundență ultra-scăzută.
4. aMIRA-Cas14a menține o specificitate ridicată, evitând falsele pozitive cauzate de amplificarea nespecifică.

În cele din urmă, integrarea într-un singur vas a MIRA și CRISPR-Cas14a elimină riscurile de contaminare și realizează o sinergie perfectă între punctele forte ale MIRA și sistemul CRISPR-Cas14a. Acest lucru rezolvă provocarea la nivel de industrie a incompatibilității dintre amplificarea izotermă și sistemele CRISPR, reprezentând descoperirea tehnologică de bază a platformei MaC14a. Sistemul aMIRA-Cas14a realizează o îmbunătățire de 1.000 de ori a sensibilității, asigurând în același timp o amplificare specifică. În combinație cu recunoașterea specifică secvenței a Cas14a, aceasta oferă validarea specificității pe două straturi, fără reactivitate încrucișată împotriva virușilor neținți sau a probelor sănătoase-care abordează un alt punct dureros al industriei: tendința de fals pozitive.

Reactivii de amplificare rapidă izotermă multienzimă MIRA utilizați în acest studiu au fost furnizați de Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Pe lângă performanța excelentă a reactivului, Amp‑future Biotech oferă, de asemenea, o echipă de asistență tehnică profesionistă și rapidă.

MIRA demonstrează o compatibilitate puternică cu cipurile microfluidice bazate pe centrifugă-, dezvoltate pentru aplicații de cercetare și diagnosticare:

1.Sistem de reacție miniaturizat, potrivit pentru camerele de reacție cu micro-volum caracteristice cipurilor microfluidice;
2.Capacitate de detectare multiple într-o singură rulare;
3. Compatibilitate cu dispozitive portabile, fluxuri de lucru fluide de la probă la rezultat.

Analizorul portabil și arhitectura cipului.

(A) Vedere explodata a dispozitivului portabil de detectare, arătând componentele majore. (B) Arhitectura modulară a cipului microfluidic centrifugal. (C) Controlul fluidic prin centrifugare. Analiza traiectoriilor de transport de lichide sub forțe centrifuge programabile.

am proiectat un dispozitiv portabil integrat de „eșantion-in, answer-out point-of-care testing (POCT) optimizat pentru implementare pe teren, așa cum este ilustrat în Fig. 4A. Prototipul compact (23 cm (L) × 21 cm (L) × 14 cm (Î), 12,5 kg masa totală) realizează o portabilitate excepțională. Componentele de bază ale sistemului includ un servomotor-de înaltă precizie pentru un control precis al rotației și o unitate de încălzire a aerului pentru reglarea temperaturii. Un modul de detectare optică integrat, poziționat sub cip, facilitează excitarea și măsurarea fluorescenței, asigurând o sensibilitate și precizie ridicate în detecție. Dispozitivul portabil este echipat cu un sistem de operare Android încorporat, oferind o interfață prietenoasă-utilizatorului, unde operatorii pot selecta fișiere de operare preprogramate care conțin parametri detaliați, cum ar fi timpul de reacție și temperatura. Rezultatele și concluziile sunt afișate în timp real-pe un ecran LCD, permițând achiziția rapidă de informații. În plus, sistemul încorporează un modul de comunicație wireless care acceptă transmiterea de date-în timp real către dispozitive mobile sau servere cloud, integrându-se cu algoritmi de inteligență artificială pentru interpretarea și analiza imediată a rezultatelor testelor.

news-800-847

Pentru a evalua capacitatea sistemului MaC14a de a detecta transportul viral în vectori de insecte, am efectuat teste de achiziție TYLCV folosind

Populațiile de Bemisia tabaci. Muștelor albe li sa permis o perioadă de hrănire de 3-zile pentru plantele infectate cu TYLCV și apoi procesate prin

Sistemul MaC14a (Fig. D). Analiza ulterioară a arătat că 8 din 10 muște albe testate (80%) au prezentat semnale virale pozitive (Fig. E). Important, toate specimenele din cohorta de control negativ (hrănite exclusiv cu plante sănătoase) și-au menținut nivelurile de fluorescență inițiale. Aceste rezultate demonstrează că sistemul MaC14a poate monitoriza cu precizie virusul și evidențiază potențialul virusului{10} pentru a evidenția virusul la nivel individual. controlul transmiterii virale în mediile agricole.

Într-un experiment ulterior de validare dublu-orb, am testat 20 de mostre de frunze de roșii (S1–S20) colectate din două zone de cultivare cu sere din Hangzhou, provincia Zhejiang, China, și din două sere.zone de cultivare din Nanning, provincia Guangxi, China. Fiecare zonăa furnizat cinci mostre de frunze de roșii care prezintă simptome tipice de virusinfecție (cum ar fi cloroza, pete de mozaic și ondularea frunzelor) și cincimuștele albe (20 în total). Sistemul MaC14a îmbunătățit AI-a livrat resulturi la minutul 5, care au fost pe deplin în concordanță cu cele obținutedintr-un test aMIRA-Cas14a de 60-min și platformă qPCR, demonstrând100 % acord (Fig. F, S6-S7, Tabelul S3). În plus, virusulspeciile detectate în probele de plante au fost foarte în concordanță cu aceleaidentificate la insectele vector din aceeași zonă de cultură. Acesterezultatele evidențiază potențialul semnificativ al-MaC14a îmbunătățit cu inteligență artificială-diagnosticarea virusului plantelor de pe site, atingând viteză mare (din acid nucleicextracție pentru citirea rezultatului în doar 10 minute), precizie ridicată (consecventăcu rezultate qPCR) și portabilitate.

Partajare articole丨O platformă CRISPR-Îmbunătățită cu inteligență artificială-Cas14a Microfluidic pentru detectarea precisă-la fața locului a geminivirusurilor din plantele de tomate și muștele albe